荧光素酶实验

实验介绍：

荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，也有科研工作者将载体改造让荧光素酶作为内参实验。萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。

实验应用：

（1）microRNA和目标基因的研究：在报告基因的3’端加上目的基因的3’UTR，就能用来检测miRNA对于目的基因的抑制作用，报告基因表达越少，说明miRNA的抑制作用越强；

（2）转录因子和下游目标基因的调控研究：在报告基因的5’端加上待检测基因的启动子，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，报告基因的表达量越高，荧光值越大；

（3）启动子活性研究：将启动子分段截断，或者点突变后构建到liciferase报告载体上，检测其启动子活性；

实验步骤：

（1）载体构建：双萤光素酶报告基因系统一般将萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒共转染细胞，或将这两个报告基因构建到同一个骨架质粒上（如pGL4质粒），分别用不同的启动子启动其表达；不同实验目的载体构建骨架不同。

（2）细胞转染：293T细胞调整状态铺板，上述质粒小提后，去掉内毒素，可以按下列分组进行转染；

A：空白组：293T细胞

B：阴性对照1：空载质粒+mimic NC

C：野生型3’UTR-质粒+mimic NC

D：突变型3’UTR-质粒+mimic NC

E：野生型3’UTR-质粒+mimic

F：突变型3’UTR-质粒+mimic

G：阴性对照1：空载质粒+mimic

（3）转染48h后，收集细胞，裂解细胞后收集上清，加入两种荧光底物后测定吸光值；

案例图片：