ROS活性氧检测

实验介绍

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。DCFH-DA(2，7-Dichlorofuorescin Diacetate)探针是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，会被细胞内的相关酯酶水解为 DCFH（Dichlorofluorescin）。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。当细胞内有活性氧存在时，DCFH 被氧化为强绿色荧光物质 DCF（Dichlorofluorescein），其荧光在激发波长 488nm，发射波长 525nm 附近有最大波峰，其荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。一般细胞内活性氧的升高是细胞凋亡的标志之一。

实验应用

ROS水平是细胞正常生理功能和环境因素导致细胞损伤的重要信号，检测细胞内ROS水平对于理解一些药物作用的信号通路和潜在作用机制具有重要意义。因此选择合适的探针检测ROS对于疾病机理研究以及药物筛选具有重要作用。

实验步骤

（1）组织样本单细胞悬浮液：新鲜取材的样本放入PBS中，清洗几次后，用剪刀切成1mm3小块，加入适量酶消化液，37℃水浴消化20-30min,期间不断震动混匀；消化结束后过滤，收集细胞，离心，用PBS清洗三次即可；

（2）DCFH-DA染色：0.2mM工作液浓度

| | 测定孔 | 对照孔 |

| 匀浆上清液（μL） | 190 | 190 |

| DCFH-DA工作液（μL） | 10 | |

| PBS（μL） | | 10 |

| 移液枪吸打混匀，37℃孵育30min |

收集孵育后单细胞悬浮液，离心PBS清洗3次，收集细胞进行荧光检测；

（3）荧光检测：

A酶标仪检测：激发波长488，发射波长525，测定其荧光强度；

B：共聚焦牌照荧光；

案例图片：