分子互作之蛋白与蛋白互作

蛋白是生命活动的执行者，可以以单一分子或者复合体形式执行生命活动。蛋白分子间相互作用是蛋白分子组建复合体、执行功能的一个途径。科沿有道可以提供免疫共沉淀、GST pull down、酵母双杂交技术检测蛋白分子间的相互作用。其中，免疫共沉淀实验结果具有更接近真实生理条件下蛋白相互作用信息的优点，配合GST pull down，可以研究蛋白之间是直接相互作用还是间接相互作用，而酵母双杂对于研究低表达的蛋白、瞬时表达蛋白具有更高灵敏度的优点。

一、免疫共沉淀(Co-IP）： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的蛋白一同随免疫复合物沉淀，然后进行检测的技术。通过免疫共沉淀可以检测两种目标蛋白质是否在体内存在相互作用（直接或者间接），免疫共沉淀后通过质谱技术也可以寻找一种蛋白在体内的相互作用蛋白。

 

1.1实验流程： （1）样品准备； （2）样品裂解、定量； （3）抗体、proteinA/G凝胶等准备； （4）沉淀收集、洗涤、制样； （5）WB检测分析。   1.2实验例图：

Co-IPs were carried out with anti-Tiam1 antibody from the lysates of the different SDC4 lines and the subsequent immunoblot was probed with anti-GFP-HRP (GFP::SDC4) or anti-Rac1 antisera, respectively. Tiam1,Rac1 and GFP::SDC4 were used as loading controls. The strongest interactions were detected in the Ser179Glu and ΔPDZ-Ser179Glu cell.   二、GST融合蛋白沉降（GST pull down）： Pull down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

 

2.1实验流程： （1）GST探针蛋白（互作蛋白）载体构建； （2）融合蛋白（互作蛋白）表达； （3）探针琼脂树脂孵育； （4）Pulldown实验； （5）互作蛋白鉴定。   2.2实验例图：

GST pulldown assays were performed by incubating purified NF110a with GST, GST-APH-2 or GST-HBZ immobilised on GST resin. The eluates were analysed by immunoblot with anti-ILF-3 antibodies (left panel) and coomassie blue staining (right panel). NF110a input corresponds to 20% of total NF110a loaded to each pulldown.   三、酵母双杂交（Y2H）： 酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。

 

3.1实验流程： （1）接收订单及样品； （2）总RNA提取； （3）mRNA纯化； （4）反转录； （5）双链cDNA合成及纯化； （6）共转至酵母感受态细胞； （7）转化效率测定； （8）文库效价测定； （9）结果交付。   3.2实验例图：

图. 酵母双杂原理图

Identification of 14–3-3γ as a direct binding partner of Best1 in the yeast two-hybrid system.   四、AP-SWATH： 生物体内的蛋白质很少单独行使功能，蛋白质之间会形成复合物来发挥功能。蛋白质间的相互作用是细胞中最基本的活动，被称为互作蛋白质组（Interactome）。研究蛋白质组相互作用的方法主要有亲和纯化（AP）、化学交联偶联质谱CXMS）等方法。其中AP技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下，能捕捉出特定的蛋白质及其分子伴侣。

 

4.1实验流程： （1）接收订单及样品； （2）亲和纯化产物； （3）LC-MS/MS； （4）数据解析； （5）互作蛋白确定； （6）结果交付。   4.2实验例图：