RIP常见问题与解答

一、什么是RIP？ RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，可以帮助我们发现miRNA 的调节靶点。 根据需求，科沿有道可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。

二、做RIP，需提供什么，可获得什么结果？ RIP技术服务，需要客户提供目的蛋白抗体（可用于IP）及其说明书；需检测的细胞样品；目的基因、目的蛋白信息。 实验完成后，科沿有道所交付的结果包含：原始数据、结果图片（包括阴性对照结果）；标准实验报告（包括详细的材料与方法）；SCI标准Result Figure。 三、RIP试验主要应用哪些方面？ 1) 已知蛋白与已知RNA互作QPCR验证；已知蛋白与未知RNA互作二代测序筛选。 2) 已知RNA与已知RNA互作QPCR验证；已知RNA与未知RNA互作二代测序筛选。 四、RIP试验需要注意些什么？ 1) 防止RNA与蛋白非特异性结合。 2) 避免RNA蛋白质结合被破坏。 3) 避免外源RNase污染。 4) 抑制内源RNase的活性。 5) 避免RNA结合蛋白的降解； 6) 选择适合做RIP的抗体，一定要是IP级别的抗体。 7) 细胞的选择，对于需要做转染实验的需要选择转染效率较高的、RNA在细胞中本底表达量要相对较高的。 五、为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白？ 1) 先进行IP或者WB，测试抗体可以与目标RBP结合。 2) 另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。 3) 尽可能选用密理博RIPAb+抗体。 4) 稀释抗体成浓度梯度，进行IP测试。 5) 4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。 6) 确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。 六、RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗？ 理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。