酵母杂交常见问题与解答

一、该如何根据研究需求选择酵母单杂还是双杂？ 1) 酵母双杂交系统主要用于研究蛋白和蛋白之间的互作； 2) 酵母单杂交系统主要用于研究DNA和蛋白之间的互作。

 

二、一般提到的酵母单双杂通用文库是什么意思？ 通过文库构建得到次级文库质粒，将文库质粒转化到Y187酵母宿主中，得到两种文库类型，可同时满足酵母单双杂公转筛库或酵母单双杂matting筛库。

 

三、酵母杂交具有什么样的优势？ 3.1从文库构建来说： ①文库构建方式灵活：根据样本的类型，提供的样本量等方面考虑，可采用smart，geteway，infusion体外重组和T4体外连接等方式进行文库构建； ②文库片段大小可控：根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小，以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素，生长因子类的小分子蛋白；转录因子，信号通路类的分子量稍大一些的蛋白； ③单双杂文库通用：构建一种类型的文库，可同时用于单双杂筛选； 3.2对于文库筛选来说： ①筛库方式多样：可采用matting或共转的方式进行文库筛选； ②互作强弱可控化：提高（降低）筛选压力，用于筛选出强（弱）相互作用的蛋白。 ③阳性结果进一步验证：文库筛选出的阳性结果，可进行点对点验证进一步排除假阳性。

 

四、酵母杂交主要技术服务内容有哪些？ 1) 核酵母单/双杂文库构建； 2) 膜酵母双杂交文库构建； 3) 核酵母单/双杂文库筛选； 4) 膜酵母双杂交文库； 5) 核酵母单/双杂点对点验证； 6) 膜酵母双杂交点对点验证。

 

五、三框文库和均一化文库具体指什么？与普通文库相比有什么优势吗？ 三框：氨基酸对应三个密码子，文库中CDNA的片段大小是随机的，读码框也是随机的，例如ATG，有可能是从A开始翻译，也有可能是从T或G开始翻译，这种情况下就只会出现一个正确的读码，三框通过人为的引入一个和两个碱基，使每个移码的基因都能正确的被读出来，这样得到的文库即为一个相对较为完整。 均一化：组织样本中会有些基因MRNA含量会很高，而有些基因含量会很低。均一化主要是将高峰度的MRNA通过人为的处理将其在总样本中的占比降下来，这样低丰度的MRNA的占比自然就会升高。如果感兴趣的基因恰好属于低丰度mRNA，那么在实现MRNA的均一性后，文库筛选更有可能的筛出目的功能基因。要注意的是均一化不建议用于研究特殊处理后的样本（如，病毒/细菌侵害，水胁迫等）。

 

六、在做酵母杂交的同时是否可以做一下相关的辅助实验？ 如果想研究蛋白与蛋白之间的互作，可以与CoIP/GST-pull downM等实验同时进行； 如果想研究DNA和蛋白之间的互作，可以与EMSA/chIP等试验同时进行。

 

七、如果诱饵可以直接激活报告基因，该如何处理？ 为保证诱饵蛋白功能的完整性，首先我们会考虑用3’AT/ABA进行背景抑制，但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3’AT超过15mM，ABA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，需要注意的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

 

八、酵母单杂诱饵启动子该选择全长还是核心区域？ 1) 全长：优点：更接近于自然条件下的启动环境；缺点：有时候过于长，导致构建具有一定的难度，更可能的产生自激活现象； 2) 预测的核心元件（<20bp）：优点：核心元件用于后续的EMSA验证试验，对核心位点进行突变验证启动效果是否减弱，相对全长启动子而言突变的区域较少操作更为方便；缺点：核心元件虽然是启动的核心区域，但是启动子的其他区域也可能是作为辅助元件而存在的，如果缺少这些部分就是非自然条件下的环境，可能产生假阴性；

 

九、进行酵母杂交文库筛选时得到的阳性结果，而进行点对点验证却出现阴性结果，是什么原因造成的呢？ 可能有以下原因： 1) 酵母杂交本身也是存在假阳性的情况，有可能这两个基因根本不互作，这样在进行单独的点对点验证时自然也不会产生互作； 2) 有些互作为瞬时互作，在文库筛选时可能捕捉导了互作，而在两个基因进行单独验证时由于互作时间的原因，最终导致结果显示为阴性； 3) 有些互作为间接互作，可能需要依靠第三个基因的作用，促进这两个基因的互作。