ATAC实验流程材料方法

一、提取方法： 采用梯度离心的方式提取细胞核，使用Qiagen PCR（28006）纯化试剂盒纯化DNA。

二、检测方法： 检测方法：取新的1.5ml离心管，加入10ul台盼蓝和10μl样品，枪头吹吸混匀，吸取10μl于细胞计数板上，置于细胞计数仪上进行计数，记录细胞浓度和细胞活性。

合格指标：细胞数大于50000个。

三、建库方法： 1、DNA的纯化及打断： （1）配制打断MIX（如下表所示）

配制完成后，用200ul枪头吹吸混匀上述MIX。

(2) 37℃、700rpm金属浴30min。

2、DNA 的纯化： （1）打断结束后，直接在原管中加入250ul Buffer PB和10ul 3M醋酸钠（PH 5），枪头吹吸混匀； （2）将上述溶液全部转移至4℃柱子（4℃保存），室温、13000 rpm离心1min； （3）弃掉收集液，将柱子放回原管，加入750ul Buffer PE，室温、13000 rpm离心1min； （4）弃掉收集液，将柱子放回原管，室温、13000rpm离心1min； （5）弃掉收集管，将柱子转移到剪掉盖子的1.5ml离心管，打开柱子的盖子，环吸去除柱子底部的剩余PE Buffer； （6）加入27μl EB溶液至柱子的中心（即白色滤膜），室温静置1 min； （7）室温13000 rpm离心1 min ，离心管底部溶液即为提取的DNA2。

3、PCR扩增： （1）配制PCR MIX ，所用试剂盒为Vazyme TD202 （-20℃保存）将提取的DNA转移至0.2ml PCR管，根据下表配制PCR MIX，配制完成后，用200μ1枪头吹吸混匀上述MIX。

PCR 程序如下：

注意：PCR产物Qubit定量浓度低于10ng/ul， 需加扩2个cycle，加扩时，去掉上述PCR程序的第一步。

4、片段筛选及文库纯化： （1）将扩增后的PCR体系转移至新的的1.5ml离心管，加入27.5uXP磁珠，枪头吹吸混匀，室温孵育5min；

（2）将离心管置于磁力架上，静置5min至液体澄清；

（3）小心将上清转移到新的1.5ml离心管中；

（4）向上述离心管中加入50uIXP磁珠，枪头吹吸混匀，室温孵育5min；

（5）将离心管置于磁力架上， 静置5min至液体澄清，弃上清，向离心管中加入200ul80%乙醇，室温孵育15s，弃上清，重复该步骤一次；

（6）取下离心管，瞬时离心3s，再次置于磁力架上，用10ul枪头除尽底部残留乙醇；

（7）打开离心管盖子，晾干磁珠至磁珠表面不反光呈雾面状态即可；

（8）取下离心管，加入2luEB，枪头吹吸混匀，室温孵育5min；

（9）将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，取出2ul上清液于新的1.5ml离心管进行2100检测，取出1ul进行Qubit定量；

（10）吸取所有剩余上清液于新的1.5ml离心管中（离心管盖上标明文库名称、出库日期、INDEX）。

5、文库质检： 文库通过Qsep-400方法进行质检，满足如下指标即可上机检测。

1）库检片段呈Ladder状，第一个主峰在200bp左右；

2）片段无前后拖尾，无接头。

四、附录信息： 1、引物接头： 使用TruePrepIndexKitV2forlumina构建的DNA文库结构如下

试剂盒中提供包含8种N5XX以及12种N7XX，可组合成96种不同的双端Index组合，用于高通量测序时区分不同样品。

2、Index的序列如下： ①N5XX：5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[ⅠⅠⅠⅠⅠⅠ]TCGTCGGCAGCGTC-3 ②N7XX：5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[ⅠⅠⅠⅠⅠⅠ]GTCTCGTGGGCTCGG-3 [ⅠⅠⅠⅠⅠⅠ]表示8bp index序列，测序前根据测序平台在Sample Sheet中输入所使用的Index对应序列。

3、实验所需的主要试剂 1)文库构建试剂盒：TruePrep@ DNA Library Prep Kit V2 for lllumina，货号TD501-TD503。 2)接头所用试剂盒为TruePrep@ Index Kit v2 for Illumina，货号TD202。 3)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads，货号N411-03。

4、所有用到的仪器： PCR仪：Life； 金属浴：天根； 掌上离心机：天根生化； 旋涡震荡器：Vortex-Genie2北京中西远大科技有限公司； 移液枪：RAININ瑞宁； 磁力架：Life； 相机：索尼； 冰箱：海尔； 四维旋转仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

5、耗材： 1.5ml离心管：Axygen； 2mlPCR管：Axygen； 10ul，200ul枪头：Axygen。

五、测序方法： 对于构建好的文库使用illumina novaseg6000进行上机测序。