彗星实验简介

一、技术简介： 彗星实验（Comet assay）也被称为单细胞凝胶电泳实验（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的技术。当各种内源性和外源性 DNA 损伤因子诱发细胞 DNA 链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。电泳过程中，如果DNA没有损伤，则将停留在原位，染色后呈圆形的荧光团，无拖尾出现。如果DNA受损，断裂的碎片进入到凝胶中，在电场的作用下，DNA碎片离开原位向阳极迁移，形成拖尾。DNA受损越严重，断裂越多，产生的碎片就越多、越小，则向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离也越长，荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。 二、实验流程：

收集细胞-铺胶-裂解-解旋-电泳-染色-观察结果。

三、实验步骤：

1. 制备单细胞悬浮液，在 37℃ 条件下，悬浮液与低熔点琼脂糖（LM琼脂糖）混合；
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2. 将琼脂糖、细胞混合物涂布在预处理的载玻片上；
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3. 4℃条件下用裂解液处理30-60min或过夜，裂解液由去垢剂及高盐溶液组成，可去除多余的细胞膜及组蛋白；
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4. 将载玻片浸入电泳溶液中；
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5. 进行凝胶电泳，随后，中和载玻片，待LM琼脂糖完全干燥后，用荧光染料染色，并于荧光显微镜下观察DNA损伤程度。

注：最常用的荧光染料是SYBR Gold，但荧光染料的观察需要荧光显微镜。如果选择银染，使用标准的光学显微镜观察即可。

四、实验结果参考：

五、送样运输要求：

提供至少5*10^5细胞量，4度运输。