克隆载体构建

分子实验——克隆载体构建

实验介绍

构建克隆载体是指利用已有的载体，通过特定的技术手段将目标基因序列导入载体上，以便进一步研究。目前成品的载体很多，目的各不相同，有简单的中间TA载体，也有表达到动物、细胞系、植物、微生物等等个体中的终载体，分别进行例如过表达、敲除、沉默基因等功能，或者进行蛋白表达等。因此克隆载体构建也是机制研究中重要的一步。

实验步骤

（1）选择载体：常规过表达载体psDNA3.1，每种载体对每种基因的效果是不大相同的，一般建议根据目的按文献或者常规载体选择，效果若不佳建议再更换载体。

（2）确定基因序列：NCBI上确定目标基因序列，同时确定是否需要密码子优化，是否需要增加其他操纵子或其他元件；

（3）选择合适构建方法：酶切或者同源重组，根据载体和序列决定；

（4）设计引物：增加酶切位点或者同源重组接头，进行PCR扩增；

（5）目标基因PCR扩增纯化

（6）酶切酶连/同源重组反应

（7）宿主细胞热激

（8）筛选阳性克隆，测序。