EMSA（凝胶迁移或电泳迁移率实验）

一、技术介绍： 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，适用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，主要是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白质分子。可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

二、实验流程： 探针设计合成-样本制备-预电泳-电泳-转膜-紫外交联-封闭-抗体孵育-洗脱-化学发光-结果分析。

三、实验步骤： （1）核蛋白提取（核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，详细步骤见试剂盒说明书） 。 （2）制胶 （1.5mm胶，大约30min胶会凝） 待胶完全凝固后120v预电泳1h，缓冲液用预冷的0.5×TBE。 （3）蛋白与探针反应(注：蛋白浓度1 μg/μl ,上样体积2 μl) 混合后室温放置25-30min。 （4）上样 预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液，加4μl的6×上样缓冲液到样品混合液中，马上上样电泳，150v ，60min。 （5）电转移 将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10min。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE，300mA转印 30min。 （6）交联 转膜完成后将膜取出，于紫外灯下20cm处作用20min。 （7）封闭 将交联完成的尼龙膜取出放入洗净的孵育槽，用封闭液封闭20min。期间放于摇床上轻柔摇晃(慢摇)。 （8）抗体反应 倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后，与膜完全作用30min。期间放于摇床上轻柔摇晃(慢摇)。 （9）洗脱 用1×的洗脱液清洗4次,每次10min。摇床速度加大。 （10）ECL发光检测： 将膜从洗脱液中取出，稍微吸干上面的液体，放入化学发光仪中，加上化学发光液，待反应1-2min后，吸尽多余的液体，开始化学发光。

四、结果案例：

五、样本要求： 1.样本类型： （1）新鲜组织，100mg以上，干冰运输；

（2）细胞量要求为10^7以上，收集细胞沉淀，干冰运输；

（3）抗体要求为EMSA级别，-20或者4℃运输。

2.客户提供： （1）基因信息、蛋白信息、物种信息；

（2）转录因子特异性抗体。

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