EMSA实验常见问题解答

一、EMSA的应用？

凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，可用于定性和定量分析；目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是转录因子研究的经典方法。

科沿有道提供EMSA检测技术服务，帮助客户检测DNA结合蛋白、特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

二、EMSA同DNA pull-down、ChIP的区别？

EMSA是用特定序列的标记探针，同待验证蛋白孵育后进行native-PAGE凝胶电泳，如果存在同探针结合的蛋白，则会出现电泳迁移率明显低于自由探针的条带出现。

DNA pull-down是将探针结合在凝胶/磁珠上，以此收集同该DNA探针发生互作的蛋白。

ChIP实验中所检测的DNA-蛋白互作则发生在活组织细胞内。

三、supershift EMSA是指的什么？

当用组织或细胞核蛋白进行实验时，无法确定与探针结合的具体蛋白，需要再提供要研究的抗体，再进行supershift实验。如果抗体能识别与探针结合的蛋白，则会出现一条超迁移条带，即可证明探针与蛋白的结合。需用IP级别的抗体。

四、EMSA实验所用蛋白如何获得？

使用天然组织细胞样本进行实验，通过抽提核蛋白获取目的蛋白，此为混合蛋白，如要确定某个蛋白结合于探针时，需要加入抗体观察是否形成超迁移条带。可以通过重组蛋白表达系统（如大肠、酵母、哺乳、无细胞等）获得特定的重组蛋白，后续实验中如出现迁移条带，则证明与该蛋白的结合作用。

五、如何缩小探针序列选择范围？

可以通过启动子序列分析查找，确定探针设计范围，如果范围太宽泛，可以先将0.5-1kb片段克隆到荧光素酶报告载体验证其启动子活性以及是否受到该转录因子调控；寻找核心启动子可以通过分段截断验证。如果研究的转录因子具有已知的结合序列motif，则可以在该motif位点选择探针。也可以先进行ChIP或DNA pull down找到富集序列之后，再设计分段探针进行验证。

六、EMSA实验存在哪些主要风险？

除了探针序列具有理论预测性、本身属于探索性实验的情况之外，组织细胞中该转录因子丰度较低、只在特定条件阶段表达，特定蛋白同DNA结合需要一定的离子或辅助因子条件（如Mg2+、Zn2+、ATP），重组表达蛋白在DNA结合活性方面同天然蛋白存在差异，结合力较弱，需要其他蛋白间接作用于DNA等情况下，都难以获得迁移条带。此外，当研究的蛋白本身pI较大（如大于8.0），蛋白在native电泳中将难以随同DNA一起向阳极泳动，或在电泳最初阶段同DNA解离开。