iTRAQ定量蛋白质组学常见问题解答

一、iTRAQ技术原理是什么？该技术的优势和缺陷分别是什么？

iTRAQ技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。

iTRAQ技术的优势：多达8标记、系统误差小、直接对二级谱定量、定量蛋白数量更多、标记效率高等。

iTRAQ技术的缺陷：应该说这是唯一的缺陷，就是定量不是当前定量技术最准确的，最准确的是SWATH和MRM技术。定量不准确的原因是附近m/z同位素的干扰，这些m/z接近的同位素引入了干扰的4标记或8标记的同位素，最终导致原本差异10倍，而干扰会将10倍变成5倍左右。当然，差异蛋白的趋势是正确的，大量发表的研究论文也证实了这一点。

二、采用iTRAQ技术对样品有什么要求？iTRAQ技术适用对象有哪些？

iTRAQ对于每一个样品的蛋白需求最少为50μg，采用4标或8标iTRAQ标记进行的iTRAQ实验，一般来说，分析的样品数量不能少于4个，采用8标标记进行的iTRAQ实验其同时分析的样品数量不能多于8个。

理论上说，iTRAQ适合任意来源的总蛋白样本，植物、动物、细菌、真菌等等。

三、iTRAQ技术一般能鉴定到多少蛋白？

iTRAQ技术一般可以鉴定到3000～5000个蛋白，具体需根据样本而定。

四、iTRAQ定量蛋白质组做完实验后，能拿到什么结果呢？

不仅可以拿到iTRAQ定量蛋白质组中的差异蛋白、蛋白的GO和KEGG归类信息、COG归类、不同样本的差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作蛋白信息等，还可以提供指定的分析内容，提供个性化的服务要求，比如转录组和蛋白质组的关联分析。

五、iTRAQ对于生物重复和实验重复有要求吗？一般发的文章都是做几个实验重复和生物重复？

一般建议做3次重复（国际认可）。关于生物学重复和实验重复，如果想通过蛋白质组学技术，去发现一些现象，则建议做生物重复，因为生物重复实际上已经涵盖了实验重复。如果希望获得一个比较满意的重复结果，可以做实验重复。

六、什么情况下适合用iTRAQ技术，什么情况下适合用lable-free技术？

iTRAQ技术，由于标记后可以提高肽段离子化效率，利于鉴定到更多蛋白质；基于低分子量端来进行定量，定量结果更准确；可以同时完成8个样品的质谱定量分析。 Label-free技术，对样本的操作最少，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。但对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高。由于实验周期以及数据准确度等方面的优势，一般推荐iTRAQ技术。

七、iTRAQ、SILAC和SWATH等相比，我更应该选择哪一种定量的方法呢？

目前主流的定量蛋白质组方法有5种，分别是iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、label-free和SWATH 。其中最流行的是iTRAQ定量蛋白质组方法，该方法不依赖样本，可以做任意样本的总蛋白质的差异定量，而且定量准确，这个层次上label-free虽然也可以做任意样本，但是定量准确度难以保障。SILAC是仅仅适合细胞层次的蛋白质组定量，组织的定量需要摸索或者前人已经摸索的模式，中途测试新组织难度较大，极易失败，细胞层次的SILAC培养费用高昂，不适合做商业化。MRM和SWATH都是目标蛋白质组相关的定量模式，但是SWATH可以完成数千种蛋白的定量，准确度极高，通量远高于MRM，对于亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本，SWATH效果非常好，当然，SWATH价格相对较高。SWATH本身对物种没有偏向性，也是目标蛋白定量的一种，定量结果准确，可以和MRM媲美，发文章更具有说服力，但是一次能定量只能达到2000多个蛋白。

八、不同老师的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机？

我们不会将不同项目的样本混合到一起上质谱。如果样品来自不同物种，那么质谱鉴定的数据库选择会不同，无法进行比较。如果是同一个物种的样品，那么经过不同实验室处理后，样品里的蛋白含量和数目会有较大差别，混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。

九、对于iTRAQ下机数据，使用什么软件分析？如何判断差异蛋白？

一般采用与Triple TOF 5600 plus配套的proteinpilot。已经有大量使用该软件发表的蛋白质组相关文献，是一款被广泛认可的蛋白质组鉴定、定量软件。我们对鉴定结果要求FDR≤1%，每个蛋白至少包含1个独有肽段。对于定量差异蛋白的评判标准，一般按照FC≥1.5，同时p-value≤0.05的标准过滤。

十、两者要有多大的差异，才叫差异蛋白？

差异蛋白是一个相对概念。一般认为当差异倍数达到1.5倍以上（但也有以差异倍数1.3倍或2倍以上），且经统计检验其p-value值小于0.05时，视为差异蛋白。

十一、为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？

表达层次即RNA层次，RNA层次和protein层次的不一致性是一个公认的事实，通常相关性只有～0.5左右，即RNA和protein往往是两个不一样的概念。引起RNA和protein差异的原因很多，比如miRNA、lincRNA、circle RNA和E3 ligase等等。