蛋白表达常见问题与解答

一、蛋白表达平台介绍

蛋白表达是现代工业、医疗和基础研究领域的重要组成部分，科沿有道蛋白表达平台可针对目的蛋白的特殊性质，专业解决蛋白表达相关难题，如蛋白产量较低、蛋白表达为包涵体、表达蛋白没有活性、表达特殊蛋白（如膜蛋白、毒性蛋白等）、制备蛋白复合物、特殊氨基酸标记技术等，帮助您获得任意想要的蛋白。

科沿有道目前主要提供普通型及上清保证型大肠杆菌系统表达蛋白服务，可提供3000余种重组蛋白产品，涵盖人类疾病相关蛋白（细胞因子、激素、酶、病毒抗原、重组抗体、片段抗体）、动植物蛋白和微生物蛋白。

二、蛋白分泌表达的优点是什么？

1) 一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质分泌到周质或培养基中可增加其稳定性；

2) 有些在细胞内表达时无活性的蛋白分泌表达时能够按适当的方式进行准确折叠，增加到蛋白的活性；

3) 由于蛋白质信号肽和编码序列间被切割，所以分泌蛋白产物不含氨基酸起始密码子ATG所编码的甲硫氨酸，而甲硫氨酸会影响很多蛋白的活性。

三、蛋白在细胞质中表达，形成包涵体的原因是什么？

胞内表达是外源蛋白在大肠杆菌中主要的表达形式。但是由于大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性，不利于蛋白二硫键的形成和稳定，从而导致蛋白的不准确折叠，形成不溶性的包涵体。

蛋白质动力学模型研究表明。活性蛋白的产率还取决于蛋白的合成速率、折叠速率和聚集速率。当外源蛋白在大肠杆菌中高效表达时，一旦形成新生肽链的聚集速度超过它们他的折叠速率就会导致包涵体的形成。

四、应如何提高蛋白的可溶性表达？

重组蛋白在大肠杆菌中大量表达时，很容易在胞内形成不可溶的包涵体，为后期的纯化复性带来麻烦。而且，复性所得到的蛋白活性很低甚至没有活性。因此，提高重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是十分必要的。

可以从以下几点进行优化：

1) 选择合适的宿主细胞；

2) 采用合适的融合标签表达；

3) 选择合适的质粒载体；

4) 优化培养诱导条件。

五、应如何选择合适的宿主细胞？

重组蛋白在大肠杆菌中表达很难准确折叠的主要原因是大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性，不利于二硫键的形成。针对这一原因，研究人员对细胞内表达，主要还原途径的两个关键酶的基因进行突变。构建了有利于二硫键形成，蛋白准确折叠的感受态细胞。如origami（DE3）,origamiB（DE3）,Rosetta-gami（DE3）,shuffle等。

六、采用融合标签表达的目的是什么？

融合标签用于检测和纯化目的蛋白。有时也通过增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白转运到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表达载体或蛋白序列中常添加一些可溶性标签，如GST、MBP、SUMO等。这些标签在宿主中表达的蛋白质会有高度的可溶性。在与外源蛋白质融合后，从而促进外源蛋白的可溶性表达。

七、影响原核表达的因素有哪些？

影响原核表达的因素包括有：翻译起始位点、GC含量、mRNA二级结构、密码子的偏爱性、质粒载体的选择、基因或者蛋白的大小、外源基因对宿主有毒性、基因突变（移码突变）、培养诱导条件等。

八、为什么实际分子量大小与理论值有偏差？

1) 翻译后的修饰（post-translational modification）如磷酸化，糖基化均能增大分子量；

2) 翻译后蛋白的自我切割（post-translation cleavage）自身断裂会降低分子量；

3) 有的蛋白有好几种异构体（splice variants），每个异构体的分子量都不一样，注意区分；

4) 自身所带电荷量有关（the composition of amino acids (charged vs non-charged)）；

5) 多聚体（multimers -）会增大分子量。

九、最终的发货形态？

可以选择液态形式或者冻干粉形式发货，蛋白冻干需要收取一定的费用。冻干粉采用去离子无菌水复溶，完全溶解即可，具体浓度根据您的实验需求而定。